細(xì)胞膜/胞漿/核蛋白分步提取試劑盒

簡(jiǎn)要描述：產(chǎn)品概述 product description 貝博® BBproExtra® 細(xì)胞膜蛋白/胞漿蛋白/核蛋白提取試劑盒適用于從各種原代或傳代細(xì)胞中分步提取膜蛋白/胞漿蛋白/核蛋白。提取過程簡(jiǎn)單方便，可在1小時(shí)內(nèi)完成。本試劑盒含有的配方能夠有效溶解細(xì)胞膜組份，包括細(xì)胞質(zhì)膜、核膜和各種細(xì)胞器膜。本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對(duì)蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、酶活性測(cè)定等下游蛋白研究實(shí)驗(yàn)。本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

產(chǎn)品型號(hào)：
廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家
更新時(shí)間：2024-11-24
訪問量：196

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產(chǎn)品分類

CLASSIFICATION

蛋白質(zhì)生物學(xué)

蛋白提取和裂解細(xì)胞器分離蛋白純化蛋白質(zhì)濃縮和緩沖液置換蛋白定量蛋白凝膠電泳免疫組織化學(xué) 查看全部產(chǎn)品

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詳細(xì)介紹

保存溫度

2-8℃

注意事項(xiàng)

1.蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲(chǔ)存。開蓋使用后-20℃儲(chǔ)存。
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。
3.試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！

有效期

一年

檢測(cè)方法

WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等

適用樣本

動(dòng)物細(xì)胞

產(chǎn)品特點(diǎn)

1.使用方便，從細(xì)胞，組織中提取蛋白不需經(jīng)過研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。
2.將蛋白提取的時(shí)間縮短至1小時(shí)。
3.含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。
4.紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。
5.蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括蛋白酶、半酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

產(chǎn)品應(yīng)用

WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等

儀器準(zhǔn)備

1.離心機(jī)
2.振蕩器
3.勻漿機(jī)/勻漿器
4.渦旋混勻器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

試劑準(zhǔn)備

1.PBS緩沖液
2.蛋白定量試劑盒

耗材準(zhǔn)備

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套

使用注意事項(xiàng)

使用注意事項(xiàng)：
? 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。
? 蛋白酶抑制劑在2-8℃時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。
? 實(shí)驗(yàn)過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過程須保持樣品處于低溫。
? 蛋白酶抑制劑儲(chǔ)存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。
? 如果試劑盒不能短時(shí)間內(nèi)用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。
? 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。
? 下游實(shí)驗(yàn)如果是進(jìn)行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性檢測(cè)，提取液可以不加蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，注意提取過程保持低溫操作，縮短離心時(shí)間。

使用方法

1. 提取液制備：
每400ul冷的蛋白提取液A/B/D中都分別加入2ul蛋白酶抑制劑混合物和2ul磷酸酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取5-10×106個(gè)細(xì)胞，在4℃，800×g條件下離心5-10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干。
3. 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4. 每5×106個(gè)細(xì)胞中加入400ul冷的蛋白提取液A，混勻后，在4℃條件下用試劑盒所配針筒反復(fù)吸吹細(xì)胞，使細(xì)胞破裂。
5. 在4℃，1000×g條件下離心5分鐘。
6. 將上清（I）吸入另一干凈離心管，在沉淀中加入100-200μl冷的提取液B，高速渦旋振蕩15秒，充分混勻。
7. 將混勻的提取液B置4℃低速振蕩30-40分鐘。
8. 在4℃，12000×g條件下離心10分鐘。將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到核蛋白。
9. 在步驟6中所得到的上清（I）中加入8ul提取液C，充分混勻。
10. 在2-8℃振蕩20-30分鐘。
11. 在37℃水浴10分鐘。
12. 在37℃下 1000g離心3分鐘，此時(shí)溶液分為兩層，上層是胞漿蛋白部分，下層部分（II）是膜蛋白約為40-50μl。
13. 將上層小心吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到胞漿蛋白。
14. 用50-100μl冰冷的提取液D溶解步驟12中的下層部分（II），即得膜蛋白。
15. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

常見問題分析

1.蛋白濃度低？
處理部分樣本時(shí)可能沒有裂解，導(dǎo)致核蛋白/膜蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長(zhǎng)試劑BC的處理時(shí)間即可。在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。
膜蛋白豐度較低，在條件允許的情況下，需要盡可能加大細(xì)胞的上樣量。

2.用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因?yàn)樵噭〢中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

3.提取時(shí)出現(xiàn)膠狀沉淀？
核蛋白提取液處理產(chǎn)物中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)少量透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)即可；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，300w/10秒間隔10秒，超聲3分鐘，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時(shí)，不必進(jìn)行超聲處理。

參考文獻(xiàn)

1.Huimin Cao, Li Wang, Beibei Chen, et al.
DNA Demethylation Upregulated Nrf2 Expression in Alzheimer’s Disease Cellular Model
Front Aging Neurosci 2015 （IF=4.348）

2.Guang Yu, Tonghai Yan, Ye Feng, et al.
Ser9 phosphorylation causes cytoplasmic detention of I2PP2A/SET in Alzheimer disease
Neurobiology of Aging 2013 （IF=6.189）

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