2-8℃避光

1.長期不用可以-20℃保存。
2.Annexin V- Alexa Fluor 488染色液避免反復凍融。多次凍融會導致失效。
3.Annexin V- Alexa Fluor 488染色液需要長期保存時可以根據(jù)情況進行小量分裝后-20℃保存。
4.試劑拆封后請盡快使用完！

1年

1.流式細胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡

1.懸浮細胞
2.貼壁細胞

1.方便：可用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測；
2.快速：1小時內(nèi)即可完成實驗；
3.準確：能準確區(qū)分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，并計數(shù)各群細胞的比例。

1.流式細胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡

1.流式細胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦
2.離心機
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

1.PBS 緩沖液（pH7.4，實驗室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套
4.鋁箔

1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體損失導致試劑量不夠用。
2.細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。離心力在不損失細胞的前提下盡可能小，重懸細胞是動作要輕柔，避免多次反復的激烈吹打。不用渦旋振蕩器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光，盡量減少它們暴露在光下的時間。有必要時可以使用帶蓋子的冰盒或鋁箔紙避光。標記后將細胞保持在避光環(huán)境中。移液過程中短暫暴露在光線下（<30秒）是可以接受的。
4.由于細胞凋亡是一個快速和動態(tài)的過程，因此在染色后立即進行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等） 試劑盒檢測凋亡需要針對活細胞。不要固定細胞，固定操作會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。

樣品染色：
1. 離心收集懸浮細胞。離心機300-500×g力，2-8°C，離心時間5分鐘，棄培養(yǎng)基。
2. 用冷PBS洗滌細胞兩次。
3. 用純水10倍稀釋10X binding buffer為1X binding buffer。
4. 用400μl 1X Annexin V binding buffer重新懸浮細胞，濃度大約為1×106 cells/ml。
5. 在細胞懸浮液中加入5 μl Annexin V- Alexa Fluor 488染色液，輕輕混勻后于2-8°C避光條件下孵育15分鐘。
6. 加入5-10 μl PI染色液后輕輕混勻于2-8°C避光條件下孵育2-5分鐘。
7. 立即用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

流式細胞儀分析：
上機檢測前，必須用待測細胞制備三個質(zhì)控樣本來設定流式細胞儀的熒光補償和設置十字門的范圍：
① 空白管，沒有染色的細胞：不加Annexin V- Alexa Fluor 488，不加PI。用于調(diào)節(jié)電壓。
② 單染管，Annexin V- Alexa Fluor 488單染細胞：用明顯凋亡的細胞，僅用Annexin V- Alexa Fluor 488染色細胞。用于調(diào)節(jié)補償。
③ 單染管，PI單染細胞：僅用PI染色細胞。用于調(diào)節(jié)補償。
④ 檢測管：待測的處理細胞，加Annexin V- Alexa Fluor 488，加PI。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
經(jīng)處理過的細胞此時可以在流式細胞儀上分析。激發(fā)波長為488nm。
按照常規(guī)的流式凋亡檢測的操作即可。
Annexin V- Alexa Fluor 488的綠色熒光發(fā)射波長530nm，信號可以通過FL1（FITC接收器）通道檢測；
PI紅色熒光在620nm，通過FL2（Propidium iodide接收器）通道或FL3通道檢測。

熒光顯微鏡/激光共聚焦觀察：
1. 滴加30-50 μl用Annexin V- Alexa Fluor 488/PI雙染的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。
2. 在熒光顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡上的FITC 濾鏡（藍光），Annexin V- Alexa Fluor 488 染色陽性的細胞將在細胞膜表面呈現(xiàn)明亮的蘋果綠色。使用Rhodamine 濾鏡（綠光），Propidium Iodide 染色陽性的細胞則會在整個胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)不同強度的黃-紅色。早期凋亡細胞不會被Propidium Iodide 染色或顯示背景熒光，而壞死或晚期凋亡細胞則會顯示出黃-紅色的胞質(zhì)，紅色的胞核和環(huán)繞細胞的綠色胞膜。在晚期凋亡細胞中還可以觀察到胞膜皺縮和起泡。

實驗過程中Annexin V染不上色或陽性率偏低?？赡艿脑蛉缦拢?br>1. 用于檢測的流式細胞儀/顯微鏡設置不當。調(diào)整使用正確的儀器設置。
2. 確定實驗中的誘導劑是否能產(chǎn)生凋亡?？赏ㄟ^設定確切凋亡誘導效果的陽性藥物對照來排除這一情況。
3. 細胞未啟動凋亡。重新確定誘導后凋亡啟動的時間點（時程實驗）。
4. 細胞數(shù)量偏少。增加細胞數(shù)量。
5. 貼壁細胞消化不當。Annexin V 跟PS 的結(jié)合需要Ca2+離子，結(jié)合液中含有Ca2+，EDTA 的消化會影響染色，建議使用無EDTA 的，或者消化后用PBS洗滌干凈。

實驗過程中陽性率偏高?？赡艿脑蛉缦拢?br>1. 用于檢測的流式細胞儀/顯微鏡設置不當。調(diào)整使用正確的儀器設置。
2. 細胞本身活力太差。實驗中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導凋亡的對照細胞經(jīng)染色后AnnexinV+/PI+雙陽性的細胞比例過高，造成這種結(jié)果的原因可能是細胞本身活力太差。建議用臺盼藍染色計算細胞的活力，臺盼藍拒染的細胞應大于95%。若活力偏低低，建議重新復蘇細胞，通常剛復蘇的細胞至少要傳代3 次以后才能進行實驗。

1.Hongjuan Li, et al.
Nucleus-targeted nano delivery system eradicates cancer stem cells by combined thermotherapy and hypoxia-activated chemotherapy
Biomaterials 2019 （IF=10.317）

2.Wei Bing, et al.
Programmed Bacteria Death Induced by Carbon Dots with Different Surface Charge
Small 2016 （IF=11.459）

3.Linchong Sun, et al.
cMyc-mediated activation of serine biosynthesis pathway is critical for cancer progression under nutrient deprivation conditions
Cell Research 2015 （IF=20.507） 4.Kerong Deng, et al.
Enhanced Antitumor Efficacy by 808 nm Laser-Induced Synergistic Photothermal and Photodynamic Therapy Based on a Indocyanine-Green-Attached W18O49 Nanostructure
Advanced Functional Materials 2015 （IF=16.836）

5.Wenqiao Zang, et al.
miR-663 attenuates tumor growth and invasiveness by targeting eEF1A2 in pancreatic cancer
Molecular Cancer 2015 （IF=15.302）